微小RNA(miRNA)是由约20-22个核苷酸组成的小的非编码RNA，其通过结合互补基因转录物来调节基因表达，从而引起mRNA的翻译抑制(Bartel 2009; Guo et al., 2010), (Volinia et al., 2006)。由于miRNA对基因表达的负调控，超过30％的微小RNA在几乎所有活生物体的基本过程中起关键作用，如分化、发育、细胞增殖和细胞凋亡(Bartel, 2004), (Esquela-Kerscher and Slack, 2006), (Calin and Croce, 2006), (Lagos-Quintana, 2001)。因为miRNA通常削弱和破坏其靶mRNA，所以与mRNA的序列伙伴的反向表达关系是值得期待的(Baek et al., 2008), (Selbach et al., 2008)。

正常组织呈现与癌组织不同的miRNA表达谱(Lu et al., 2005), (Volinia et al., 2006)。miRNA的调节异常能够促进肿瘤的形成和发展(Croce, 2009), (Lujambio and Lowe, 2012)。在对于相应对照的癌症中差异表达的miRNA之间的比较已经在先前的卵巢癌的研究中进行。表达水平被分为异常高和低，或没有miRNA的表达(Iorio et al., 2007), (Zhang et al., 2008), (Wyman et al., 2009)。例如，在卵巢癌中过表达的微小RNA是mir-27a，mir-27b mir-23b，miR-503，miR-346和miR-424，其与转移的程度相关(Wang, Kim, and Kim, 2014), (Park et al., 2013)。相关研究已经表明mir-199a可以抑制CD44基因的表达，导致抑制卵巢癌起始细胞的致瘤性和多药耐药性(Cheng et al., 2012)。类似地，负责常见的DNA损伤反应途径的hsa-miR-140-3p靶向RAD51AP1基因显示卵巢癌中的表达显着降低(Miles et al., 2012)。

癌症基因组图谱(TCGA)是一个公共可用的癌基因组数据库，提供与个别人类癌症类型相关的基因组数据(“癌症基因组图谱-数据门户”2015)。在过去的十年中，癌症基因组图谱(TCGA)项目已经是一个大规模的合作项目和一个强大的数据库门户，让我们搜索和比较各种癌症的分子异常综合目录。数据使我们在卵巢癌中找到上调的和低调节的miRNA。 我们使用无偏差的方法在癌症和正常对照中来选择最差异表达的miRNA。我们使用一种新的策略来分类microRNA在卵巢癌的表达数据，因为miRNA和其目标mRNA有可能改变癌细胞中的分子和生物过程，导致发现新的治疗选择。

材料和方法

患者样品

卵巢癌miRNA和对照数据，级别3，从TCGA(02/05/2014)下载。数据分析如流程图所示(图1)。 根据表达水平，使用R统计程序分选和提取485名癌症患者和22名对照的数据。 R原始脚本已被写入以检测癌症中的异常miRNA。

图 1 卵巢癌miRNA数据流程图. 该图呈现了数据挖掘工作的每一步; 从TCGA下载, R统计过程, 选择microRNA, REC分数以及分子和生物学功能. 该流程图说明了整个数据挖掘过程; Flow chart of ovarian cancer miRNAs data process. The figure presents each step of the data mining work such as; downloading from TCGA, R statistical process, selection of the microRNA, REC score and molecular and biological functions. The flow chart explicates the whole data mining process

 

数据预处理

数据首先下载，然后分为两组，卵巢癌和对照组。然后分别收集相同的ID微RNA表达作为患者和对照。数据预处理已通过查找其倍数更改完成。

表达分析

提取的miRNA已经应用于Cancerminer(www.cancerminer.org)，其是计算miRNA-mRNA之间可能的相互作用并产生作为REC分数的结果的基于网络的工具(“CancerMiner”2015)。高和低表达的miRNA(图3)通过生物信息学工具HCE 3.5软件程序(http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/)(“HCE-Hierarchical Clustering Explorer”2015)分级聚类。软件程序具有不同的参数，但在本文中，欧几里德距离已被用于聚类并找到它们的相关性。靶基因的负面影响的分子和生物学功能使用http://www.pantherdb.org/(“PANTHER-Gene List Analysis”2015)分类。

图 3 卵巢癌中高和低表达的miRNA. miRNA变化谱在卵巢癌中呈现高和低表达. 比较后，96个未表达的miRNA和134个最小表达的miRNA被检测到高表达的miRNA. 然而，在对照中139和156高表达的miRNA在卵巢癌中表达为0和最小; The high and the low expressed miRNAs in ovarian cancer. The miRNA changes profile is presented high and low expressed in ovarian cancer. After the comparison 96 non- expressed and 134 minimum expressed miRNAs are detected high expressed miRNAs. However, 139 and 156 high expressed miRNAs in control is expressed 0 and minimum in ovarian cancer

 

结果

数据的提取

R代码将680种不同miRNA的表达分为3个主要组：高、低和未表达(图1)。根据每百万绘图读数的表达值，数据显示了230个高表达的miRNA和295个低表达的miRNA(图2)。此外，其中155个几乎是被动的，并且在癌细胞和正常细胞中均不表达(图2)。

图2 卵巢癌上调和下调miRNA数量. 图中的数字标记卵巢癌miRNA活性. miRNA主要分为3组, 上调, 下调和不表达. 从数字可以容易地检测到作为癌症的结果有多少微小RNA表达已经改变; Ovarian Cancer Up and Down regulated miRNAs numbers. The numbers in the figure label ovarian cancer microRNA activities. The microRNAs are separated mainly into 3 groups, up regulated, down regulated and not expressed. From the numbers, it can be easily detected how many of the microRNAs expression have been changed or not as a result of the cancer

 

一旦我们发现高和低表达的miRNA，我们将它们与其在对照样品中的表达进行比较。我们发现一些miRNA在对照样品中根本不表达。因此，我们希望将候选miRNA分为两组：第1组是在对照中显示零表达的miRNA，第2组是在对照样品中显示一些表达的miRNA(图3)。我们对高和低表达的miRNA进行了这种分析(图3)(附表1)。该分析发现96种不同的miRNA在癌症中高度表达，但在对照样品中没有表达。此外，在卵巢癌中高度表达的134种miRNA在对照样品中显示最小表达。

表 1 基于REC评分选择的上调miRNA和其靶mRNA。 基于它们在卵巢癌中的高表达，选择miRNA与对照相比。 使用Cancerminer数据库发现靶mRNA, 并基于REC分数进行选择. 某些miRNA在Cancerminer数据库中没有发现, 排除了这些miRNA. 73%的microRNA与肿瘤发生相关; The up regulated miRNAs and their target mRNAs selected based on the REC score. miRNAs are selected based on their high expression in ovarian cancer as compared to controls. The target mRNAs were found using Cancerminer database and selected based on REC score. Some miRNAs were not found in the Cancerminer database and those were excluded.%73 of the microRNAs are related to tumorigenesis

 

对于低表达miRNA，我们发现139个miRNA在癌症样品中显示零表达并在对照中高表达。此外，我们发现156个miRNA在癌细胞中具有最小表达，在对照中具有高表达(图3)。 由于一些候选miRNA具有非常高或非常低的表达，我们决定仅选择表达改变>50倍的候选物。该分析发现31个异常高和89个低表达的miRNA(候选物的列表在附表2中给出)。非表达的miRNA(n = 155)在附表2中给出。

表 2 基于REC评分选择的下调miRNA和其靶mRNA. 基于它们在卵巢癌中的低表达, 与对照相比选择miRNA. 使用Cancerminer数据库发现靶mRNA, 并基于REC分数进行选择. 某些miRNA在Cancerminer数据库中没有发现, 这些从表中排除. 22%的microRNA与肿瘤发生相关; The down regulated miRNAs and their target mRNAs selected based on the REC score. miRNAs are selected based on their low expression in ovarian cancer as compared to controls. The target mRNAs were found using Cancerminer database and selected based on REC score. Some miRNAs were not found in the Cancerminer database and those were excluded from the Table. 22% of the microRNAs are related to tumorigenesis

 

特定miRNA的分层聚类

在癌症中通过R程序选择的高和低表达的miRNA被分层聚类以理解它们之间的可能的相关性。最相关的17个上调调节的癌症miRNA是分层聚类的。聚类图显示miRNA的活性和彼此之间的关系(图4)。miRNA家族如mir-509-1,-2，-3、mir-129-1,-2、mir-663,-b和mir-200a,-b是高度表达的，并且是最相关的。低表达的癌miRNA也彼此高度相关，并由除mir-519a-2和mir-519a-1之外的不同miRNA组成(图4)。

图 4 高和低表达microRNA的分层聚类. 作为统计分析的结果，最高的17个和最低的17个相关的microRNA中的显示为热图. 第一个图显示上调的microRNA, 第二个图显示下调的microRNA; Hierarchical clustering of high and low express microRNA. As a result of the statistical analyses, 17 of the highest and 17 of the lowest correlated microRNAs are shown as a heat map. The first figure shows up regulated microRNAs, and the second figure shows down regulated microRNAs

 

miRNA和靶基因的REC评分

       为了找到miRNA-靶相互作用之间的关系，已经开发了Cancerminer工具[22]。该工具将结果作为REC评分，基于秩的统计方法，已经被开发以理解具有阴性表达关联的miRNA-mRNA对具有与弱或正关联对相关的预测miRNA-靶相互作用[22]。基因和miRNA的表达具有拮抗性。最高表达的31个miRNA已经应用于Cancerminer工具，但是其中只有22个具有确定的REC评分(表1)。除了REC评分之外，在22种miRNA中已经确定卵巢癌中的相关性评分(表1)。有趣的是，大多数靶mRNA参与肿瘤发生。清楚地发现73%的微小RNA与肿瘤发生直接相关。

对低表达的miRNA进行类似的分析(表2)。在89个具有>50个更低表达的miRNA中，54个miRNA定义了REC评分和相应的靶mRNA。下调的microRNA与肿瘤发生的关系只有22%。显然，上调的微小RNA与肿瘤发生更相关。

受miRNA影响的分子活性，生物功能，细胞组件和蛋白质类别

癌症的细胞活性显然受miRNA影响。根据REC评分，mRNA被分类以便理解提取的miRNA如何在癌症类型中对分子活性、生物学功能、细胞组分(图5)、蛋白质类别和途径(图6)具有活性和负面影响。可以容易地观察到何种机制改变或可能改变，如通过癌症类型中的百分比检测。

Figure 5 高表达的miRNA在卵巢癌中的生物过程, 分子功能和细胞组分的变化. 异常表达的microRNA抑制细胞中的一些重要过程. 根据REC评分, 列出mRNA并通过REC程序运行以发现其自身生物过程, 分子功能和细胞组分的变化. 所有的变化在图中以百分比给出以便清楚地检测变化; Changes in biological process, molecular function, and cellular component in ovarian cancer by high expressed miRNAs. Aberrantly expressed microRNAs repress some vital processes in the cell. According to REC score, mRNAs are listed and run through the REC program to find changes in their own biological process, molecular function and cellular component. All of the changes are given as a percentage in the figure to clearly detect the changes.

 

图 6 蛋白质类别和途径的变化; Changes of Protein Class and Pathway

 

结论

癌症和正常卵巢组织样品(高或低)之间的微小RNA表达的变化表明存在miRNA的动态表达。尽管miRNA的序列与许多基因互补，但它们显示了对特定基因的偏好。根据miRNA和mRNA之间的拮抗关系，细胞中的一些功能被抑制。本研究的主要目标是了解miRNA如何在卵巢癌中异常表达、破坏细胞平衡和致癌。我们发现在680种不同的miRNA中，230显示高表达和295显示低表达。此外，与卵巢组织的对照样品相比，在癌症中，31显示>50倍更高的表达，和89显示在癌症中>50倍更低的表达。这项工作将帮助分子遗传学家和临床医生制作针对不同基因的新药物。

缩写

TCGA: The Cancer Genome Atlas Data Portal REC Score, association recurrence (REC) score Cancerminer, microRNA finder tool

利益冲突

作者声明本研究没有利益冲突。

作者贡献

SDogan开展了生物信息学和数据挖掘研究，分析microRNA表达水平，进行统计分析，起草了稿件。AKozaric实施了microRNA在癌症中的分子效应。本研究的设计由两位作者完成。两位作者阅读并同意了最终稿件。

致谢

首先，我们感谢TCGA，癌症基因组Atlas数据门户，通过在线提供卵巢癌microRNAs基因表达数据。同时，我们感谢Sead Banda对图表的设计。

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